摘要 
    麦芽经粉碎，添加糖化酶（1,4-α-D－葡聚糖水解酶），在70０C等温糖化生产麦汁，当原麦汁浓度在420S,真正发酵度达到87%，而啤酒中的残糖小于0.75%w/v。并对糖化PH值，钙含量，添加酶的用量以及糖化时间等影响因素进行了研究，该方法甚至对溶解不良的麦芽也有好的效果。糖化酶样品中在所允许的蛋白酶活性范围内，中试结果表明对啤泡沫质量无影响。该方法的优点是在麦汁煮沸期间可确保糖化酶失活，而且在煮沸之前比其它酶处理麦汁的时间短。 
    关键词：糖化酶，低糖，糖化，高发酵度，麦汁。 
引 言 
    消费者需要低糖产品，促使酿造工作者研究开发低糖啤酒，而生产低糖啤酒有两个途径，第一个途径是制备的麦芽汁中有很高可发酵性糖(80%-90%)。加一途径是在传统发酵(65%-7 0%)的基础上在特殊的条件下进行转化。这两种途径发酵均需比传统酿造啤酒需要更高可发酵性糖。因此，低糖或高发酵度的啤酒比相同的原麦汁浓度的一般啤酒的乙醇含量高。 
    制备高发酵度的麦汁方法较多，如在糖化或糊化时添加具有高发酵性的辅料（例如蔗糖或葡萄糖浆），或在糖化时添加葡萄淀粉酶或脱支酶）。或在煮沸前，添特种麦芽，使麦汁中含有高可发酵能力的糖，或几种方法相结合应用。 
    采用特殊发酵的方法生产高发酵度的啤酒，由常规的麦汁转化成高发酵糖的方法有直接添加具有高含量可发酵性糖用于发酵，添加麦芽酶，糖化酶，脱支酶等酶化转换残余糊精或用具有高发酵性能的酵母。 
    如果生产厂家也生产常规的啤酒，必须注意麦汁或啤酒或酵母所经过的管道，必须严格避免产生风味和微生物稳定的影响及危害。另外，糖化酶广泛用于啤酒生产，一般在巴氏灭菌区域不完全失去活性，存在于啤酒中的活性酶可以成为示踪物，基于这一原理，许多酿造者十分喜欢具有高发酵性的麦汁，生产高发酵度的低糖啤酒。特制的麦芽不宜大规模生产，当用辅料，例如，添加大量蔗糖可导致麦汁氮源不足，因此，先把酶添加到麦汁中煮沸是最佳的选择。 
    在一般糖化条件下，麦芽中的酶是不能完水解存在于支链淀粉中α-(1→6)键以及麦汁中的非发酵性糊精。要生产具有高发酵性能的麦汁，酿造者只添加酶，例如，糖化酶，支链淀粉酶（普鲁蓝酶）异构淀粉酶才有能力水解α-(1→6)键。糖化酶能水解存在于淀粉中α-(1→４)键和α-(1→6)葡萄糖苷键而产生葡萄糖；而支链淀粉酶和异构淀粉酶只能水解α-(1→6)键。酿造车间使用这些酶不是在糖化时添加，就是在直接添加到麦汁中。葡萄糖淀粉酶可完全水解淀粉成葡萄糖。 
    在一定的糖化温度，通常认为葡萄糖淀粉酶有热不稳定性。因此，有部分酿造者用葡萄糖淀粉水解麦汁成糖，生产高发酵度的啤酒。本方法包括冷却未煮沸的麦汁至600C或稍低，按量添加葡萄糖淀粉酶并保持在设定温度长达4小时。然后在该麦汁中添加酒花，煮沸。因此，进入发酵罐前，糖化酶已失去活性。Arasaratnam等人研究了细菌α-酶和真菌糖化酶作用玉米淀粉和热稳定性的协同作用，发现了在温度为700C,PH=4.6时，仅用3小时就可完全水解，这使我们认识到在麦芽糖化时淀粉水解的类似性，用从黑曲霉的糖化酶与内生的α-淀粉酶作用相同。 
    本文研究了采用在高温用糖化酶糖化麦芽粉生产具有高发酵性能的麦汁。该方法生产的啤酒与添加酶到预煮沸麦汁中生产的低糖啤酒进行了比较。 
实验方法 
酶的分析 
    酶：使用的全部酶制剂均由不同单位提供食品级产品。从黑曲霉中制取糖化酶（1,4-α-D葡萄糖水解酶）。从厄默桑青酶中制备β-葡聚糖酶。 
葡聚糖酶活性 
    该底物量0.1MNaAc缓冲液中，PH=4.3含2%w/v麦芽糖组成。把麦芽糖培养基1ml在40 0C保温3分钟，添加合适的稀释酶溶液1ml混匀。在40 0C反应10分钟后，添加PH=7.6,1.66M三羟甲基氨基甲烷缓冲液3ml.取酶溶液与培养基和三羟甲基氨基甲烷缓冲液混合制成空白。用GOD-PAP酶分析法测定葡萄糖。一单位酶的活力量指在温度为400C, PH=4.3每一分钟作用1微摩尔麦芽糖。 
    β－葡聚糖酶活性把1g大麦β－葡聚糖溶于80ml去离子水中，并煮沸10分钟。过滤后，冷却，添加PH=5.0,1.0M醋酸缓冲液10ml,定容至100ml。 
3，5-二氮水杨酸溶液的制备：称1g3,5-二氮水杨酸溶于加热的16ml10%NaOH,30gC4H4KNaO6˙4H2O和50ml去离子水中。该溶液冷却后，用去离子水稀至100ml,避光保存。把稀释到合适浓度的底物和酶在50℃贮存10分钟。每添加1ml均在500C保温10分钟，以水代替酶作试剂空白。添加2ml二氮水杨酸并煮沸5分钟，终止反应。首先把该混合物置于外面却6分钟，随后浸于200C水浴恒温10分钟，加10ml水后，在540nm，以水为空白，测定吸光度，β－葡聚糖酶一单位定义为：在500C，PH=5.0,每分钟分解麦芽糖产生1mg还原糖的酶量为一个酶活力单位。 
蛋白质分解活性 
    利用变性的血红蛋白作底物，应用分光光度计测量蛋白质分解活性，蛋白酶活力单位，血红蛋白单位均以泰乐菌素为基础(HUT)定义：１分钟水解酶在275nm产生的吸光度与在0.006MHCl介质含1.10μg/ml的泰乐菌素吸光度相同的酶量。 
实验室糖化 
    100g粉碎的麦芽与300ml酿造用水混合，并补充一定的CaCl2.添加6MH2SO4调节糖化PH值。添加糖化酶和热稳定性的β－葡聚糖酶。按糖化程序10C/min升至780C保温10分钟，在780C用去离子水使糖化醪达到550g,并经折叠滤纸过滤，首先50ml滤液再重新过滤。在沸水浴中加热麦汁10min,冷却后，分析前用0.12μm孔径滤纸过滤。 
分析 
    按照以前介绍的方法分析麦芽和麦汁，测定麦汁中糖类物质是根据Madigan等人介绍的梯度层析离子色谱下电化学脉冲分析其含量。酸解后，测定啤酒中的残糖，取除气的啤酒5ml,2.5MHCl2ml,去离子水4ml于试管中混合。用聚四氟乙烯盖密封，在1050C加热3h。应用GOD酶化反应分析水解的葡萄糖。 
中试规模糖化 
    把粉碎的麦芽在700C,用H3PO4调节至PH=4.6，添加糖化酶和β－葡聚糖酶(250单位／Kg麦粉),糖化醪在700C保温2h，以10C/min升至780C，保温110分钟，用这种方法生产高发酵度的麦汁。用淀粉葡萄糖苷酶与不同量辅助活性蛋白酶（分别用5和7号酶分别酿造Ａ和Ｂ表Ⅳ，而对照样品，按传统浸取糖化程序生产麦汁。添加糖化酶（编号为5，表Ⅳ）到麦汁中，在580C保温４h，煮沸麦汁，添加酒花，发酵，3个酿造厂生产步骤相似。 
结果与讨论 
    糖化酶是从黑曲霉制取的一种耐高温酶，众所周知，在750C和PH=4.5的条件下，该酶具最佳活性。在PH=5左右，温度低于600C，该酶制剂稳定，而且，当添加糖化酶到麦汁中，经麦芽α-淀粉酶和β-淀粉酶分解淀粉，其作用原理与糖化酶一致。在测定这些酶的最佳条件下，便可制备出高发酵性的麦汁而且收得率很高，达到生产具有高发酵性麦汁的目标、。另一些因素，像麦汁α-氨基氮和粘度，从酿造的角度考虑是十分重要的。 
    从表观发酵度计算麦汁真正发酵度。在正常情况下，麦汁中主要是麦芽糖，增殖因子为0.189，而100%葡萄糖浆的增殖因子为0.857，发现使用糖化酶制得的麦汁样品中所形成的葡萄糖的可发酵性糖超过92%，增殖因子为0.857。因此，这里报导的真正发酵度与预计的值略高。理论上计算麦汁的最高发酵度为92.5%，而这在实践中是从来没有达到。特制啤酒必须列出乙醇和残糖浓度，从而才可计算出麦汁的真正发酵度。对于高发酵度啤酒，乙醇为5.5%v/v，残糖浓度小于0.75g/100ml。麦汁的真正发酵度必须大于85.2%，本研究的目标，使麦汁的真正发酵度达87%。 
    为达到快速而价廉这一目的，必须选择最佳条件，用糖化酶生产具有高发酵性能的麦汁的最佳糖化PH=4.5-5.6(图1)。这种最佳PH值，对麦芽中α-淀粉酶不适宜。当糖化PH值调不到该值时，麦汁发酵度就会降低。 
    在700C糖化，此时蛋白质分解作用小，浓度为420S，麦汁中含α-氨基氮160-190mg/L,用糖化酶作酶制剂，蛋白质分解的付活性为0.12HUT/糖化酶活性单位，α-氨基氮含量在这种范围内，能满足发酵的条件。如果在麦汁中需增加氮含量，如调节辅料用量，在较低温度配料不当，如表1说明，在650C，延长糖化时间15min，保温在700C，在麦汁中α-氨基氮增加约20mg/L。 
    我们还研究添加到麦汁中的糖化酶的量约为9,000-1,7000活性单位／Kg（图２）。要迅速提高真正发酵度，添加糖化酶量要超过13,000活性单位／Kg的酶,到此限度后，可增加发酵能力很少，但是在添加1,3000-14,000活性单位／Kg的酶到麦粒中的结果表明，生产的麦汁可使真正发酵度达87%或者超过87%。 
    为达到预期的发酵能力，需要对糖化时间进行研究。在７00C，用12,000活力单位／Kg麦粉糖化酶对麦芽进行糖化，终止糖化，收集糖化60,90,120min后的麦汁（图３）。当糖化为60min,真正发酵度可达86.7%,而糖化时间为90～120min,真正发酶度超过87%。 
    在700C, PH=4.6糖化，对麦芽中的酶作用不是最佳条件。而且钙对α-淀粉酶有影响。我们研究了糖化时需钙的量，虽然糖化液钙含量具有12mg/L,添加一定的钙。使钙含量在50-100mg/L，不可能对麦汁的萃取，麦汁发酵度或α-氨基氮造成影响，并发现用H3PO4调节PH时，能减少可利用的钙。 
在700C麦芽β-葡聚糖酶迅速作用，在该温度条件下，能促使引起麦汁粘度增加高分子。β-葡聚糖溶解。本实验所用麦芽溶解度（表Ⅱ）和萃取率好，在600S有较合适的粘度1.4Mpa.S。在糖化添加250活力单位／Ｋg麦粉的真菌β-葡聚糖酶，使粘度降至1.2mPa.S(表Ⅲ)，说明β-葡聚糖酶，对在生产过程中溶解不良的麦芽是有用的。 
    质量差的麦芽转化是比较难的，含有较高的β-葡聚糖生产的麦汁粘度高，认为不适宜生产。在中试时，用较短的发芽时间，生产出溶解度差的麦芽。而运用这种不良麦芽，研究该方法的有效性。只发芽３天的麦芽脆度低，粗细粉萃取率差比正常麦芽高（表Ⅱ），证明溶解度差，可是，从溶解度较差的麦芽制得的麦汁的真正发酵度大于87%，比正常贮存麦芽获得的发酵度高（表Ⅲ）麦汁的粘度高，只有添加250单位／Ｋg麦粉，方可生产合适粘度的麦汁（表Ⅲ）。这些结果表明，试验的这种方法，即使溶解差的麦芽，也能生产高发酵度的啤酒。 
    不同的供应商提供的糖化酶，即使从相同微生物衍生出的酶，他们的特性及副作用可以不同。从生产低糖啤酒的观点更重要的是蛋白分解酶和转糖基的副作用。由于长时间反应和高浓度葡萄糖，在反应介质中易发生转糖基的作用，据介绍，导致形成麦芽糖，异麦芽糖，麦芽三糖或其它低α-葡聚糖。这些即使是麦芽糖，如果酵母存在于葡萄糖介质中，麦芽糖受到抑制，可能不会发酵，当在预煮沸的麦汁或在发酵时添加糖化酶，蛋白质分解的副作用危害啤酒泡沫的质量，因此，该方法使用酶特别注意含蛋白酶应很低。生产酶的时间长而且费用高，５家不同供应商提供的８种糖化酶，经小规模糖化结果比较见表Ⅳ。全部糖化酶是由黑曲霉生产而成，以活性为主，除６号和８号外含有糖化和普鲁蓝酶混合，后者是由普鲁酸杆菌衍生而成。当添加一定的量（１0,000单位糖化酶／Kg麦粉）糖化，可以看出真正发酵度大于86%,麦汁糖化曲线相似。总的可发酵性糖，麦芽糖占0.9-1.7%,是否因水解不完全或转糖基作用，仍在研究。 
    制备的糖化酶中的蛋白酶副作用范0.02-0.62HUT/uAMG(表Ⅳ)，分解蛋白活性与麦汁中α-氨基氮呈正相关，当提供能提高FAN的糖化酶证明对啤酒泡沫没有负面影响。同时生产含低蛋白酶的糖化酶产品需要昂贵费用。采用小型糖化（50Ｌ），用低蛋白酶（表Ⅳ中的5号酶）和常规的（表Ⅳ中的７号酶）糖化酶分别酿造啤酒Ａ、Ｂ，检查糖化酶对啤酒泡沫的影响。如实验方法介绍在按传统方法煮沸麦汁前，添加含微量蛋白酶的糖化酶（表Ⅳ中的５号酶）生产的啤酒与对照样品比较。 
    所有的麦汁真正可发酵能力为85.7%或更高些（表Ⅴ），添加糖化酶酿造的产品Ａ与对照样品Ｂ的真正发酵度低，发酵终止。产品Ａ的比重大于１。实验证明添加14,000单位／Kg麦粉糖化酶，就可生产高发酵度啤酒。 
    分析啤酒的结果（表Ⅳ）表明所有啤酒相应残糖量与目标残糖含量<0.75g/100ml很接近。实验证明，在糖化时按要求添加微量蛋白酶的糖化酶，不是在糖化中就是在麦汁煮沸前，采用Rudin法测量啤酒的泡持性很好。 
    也有人报道了在糖化时用糖化酶生产低糖啤酒。Willox等人采用在550C和710C浸取的程序，糖化时未调PH，添加少量的脱支酶，并没有观测到麦汁表观发酵度增加。Enevoldsen把高浓度的糖添加到正常麦汁去生产高发酵性能的麦汁，由于麦汁中的氮含量的变稀、对发酵特性和啤酒风味可能造成不良影响。他提出，用糖化酶和其它的脱支酶达到增加可发酵性糖，以免减少对糖的依赖。在糖化浸取程序中，没有调PH值，在糖化时约添加1,800糖活性单位／Kg麦粉、成功地使麦汁真正发酵度从68%提高到72%,仍需给萃取的麦汁提供50%的蔗糖。 
    当未添加糖化酶等温糖化时，导致β-淀粉酶迅速下降，可发酵性糖相对减少20%.我们现在用浸取糖化生产高发酵性的麦汁是根据麦芽中和添加的糖化酶（从黑曲霉中制备）相互作用，糖化酶中的蛋白酶作用增加麦汁中α-氨基氮，对啤酒泡沫没有危害。在700C，调节PH=4.6在糖化开始时添加糖化酶糖化２小时，生产的麦汁真正发酵度87%。本文提供了一种生产低糖啤酒的生产工艺，而不像其它糖化工艺需添加可发酵性的辅料，比较而言，这种工艺不需要特制的麦芽或酵母，也不会有因麦汁长时间转至预沸而造成污染。